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Unità di ricerca di Analisi Farmaceutica e Biofarmaceutica  

Componenti: Prof.ssa Marina Carini, Prof. Giancarlo Aldini, Dott.ssa Marica Orioli, Dott. Giangiacomo Beretta

Collaboratori alla ricerca (assegnisti e dottorandi)
: Mara Colzani, Luca Cannizzaro,  Danilo De Maddis, Davide Garzon, Alessandra Altomare

Il team, organizzato in due principali subunità (Bioanalisi e Proteomica), si occupa dei diversi aspetti dell’analisi strumentale nelle scienze farmaceutiche. Tra i principali interessi di ricerca, l’identificazione di biomarkers e target farmacologici; lo studio delle interazioni farmaco-target molecolare mediante spettrometria di massa; il metabolismo di farmaci e xenobiotici; la progettazione e sviluppo di molecole biologicamente attive; il controllo qualità di farmaci, dispositivi medici, integratori nutrizionali, estratti vegetali e cosmetici; l’isolamento, la caratterizzazione e valutazione in vitro e in vivo dell’attività biologica di principi attivi di origine naturale.

In particolare, il team ha sviluppato un’ampia gamma di esperienze complementari nelle seguenti aree di interesse.


1) Studio dei processi di ossidazione e carbonilazione proteica mediante tecniche di proteomica e spettrometria di massa
La tematica di ricerca si inquadra nell’ambito di un progetto di ricerca internazionale (in collaborazione con la Tuft’s University, Boston, USA e Nagoya University, Giappone) finalizzato alla identificazione e caratterizzazione di nuovi target farmacologici e biomarkers dei processi degenerativi su base ossidativa e carbonilica. La ricerca in questo ambito si è focalizzata sullo sviluppo e applicazione di metodologie LC-MS/MS e immunoistochimiche per l’identificazione di modifiche post-trasduzionali di peptidi e proteine in diverse matrici biologiche come biomarkers precoci di danno ossidativo/carbonilico.
Il riconoscimento a livello internazionale di questa expertise ha consentito al Prof. Aldini di essere nominato delegato per l’Italia nell’ambito della Commissione COST Action CM1001 (Chemistry of non-enzymatic protein modification - modulation of protein structure and function).

Yamaguchi S, Aldini G, Ito S, Morishita N, Shibata T, Vistoli G, Carini M, Uchida K. Delta12-prostaglandin J2 as a product and ligand of human serum albumin: formation of an unusual covalent adduct at His146. J Am Chem Soc. 2010 Jan 20;132(2):824-32.

2)   Studio delle interazioni covalenti e non covalenti ligando-macromolecola mediante spettrometria di massa.
Questa area di ricerca riguarda l’identificazione e caratterizzazione di ligandi (covalenti e non) di macromolecole, in particolare proteine e acidi nucleici, mediante approcci diversificati di proteomica e spettrometria di massa, inclusa la spettrometria di massa ad alta risoluzione (HMRS). Il progetto, svolto in collaborazione con un gruppo di ricerca spagnolo, ha come principale obiettivo la caratterizzazione del legame covalente dell’amoxicillina con le proteine seriche, al fine di delucidare il meccanismo delle reazioni allergiche indotte dalla molecola stessa. In questo contesto, la spettrometria di massa ad alta risoluzione rappresenta un nuovo utile strumento per lo studio del meccanismo di aptenazione delle proteine.
La stessa metodologia HRMS viene utilizzata negli studi di drug discovery, ed in particolare per lo studio delle interazioni non covalenti  ligando-macromolecola. Questo tipo di applicazione, particolarmente innovativa, non solo consente una rapida identificazione dei composti bersaglio a partire da spettri di miscele complesse, ma anche di ottenere informazioni riguardanti il complesso ligando-target, inclusa la stechiometria di reazione, le costanti di associazione e l’effetto del ligando sulla conformazione proteica.
Questo nuovo approccio è stato utilizzato per la caratterizzazione di piccoli ligandi  della beta2-microglobulina (in collaborazione con l’Università di Pavia) e di altre molecole a basso peso molecolare in grado di riconoscere il mismatch T:G, un approccio utile per la progettazione di nuovi farmaci antitumorali (in collaborazione con Nerviano Medical Sciences).

Ariza A, Garzon D, Abánades DR, de Los Ríos V, Vistoli G, Torres MJ, Carini M, Aldini G, Pérez-Sala D Protein haptenation by amoxicillin: High resolution mass spectrometry analysis and identification of target proteins in serum. J Proteomics. 2012;77:504-20.

Riccardi Sirtori F, Aldini G, Colombo M, Colombo N, Malyszko J, Vistoli G, D'Alessio R. Molecular recognition of T:G mismatched base pairs in DNA as studied by electrospray ionization mass spectrometry. ChemMedChem. 2012;7(6):1112-22

3) Identificazione e sviluppo dei derivati della carnosina ad attività detossificante le specie reattive carboniliche (RCS) citotossiche.
Il progetto di ricerca, in collaborazione con un partner industriale e con numerosi laboratori accademici nazionali e internazionali, ha come obiettivo la progettazione, sintesi e sviluppo di nuove molecole ad attività detossificante le specie RCS che si originano dai processi di ossidazione a carico di lipidi e zuccheri. Il progetto include una fase di screening in vitro di attività e stabilità metabolica delle molecole progettate, cui seguono fasi di valutazione in vivo delle proprietà farmacocinetiche e infine farmacodinamiche, ove i composti guida vengono valutati in diversi modelli sperimentali di patologie su base ossidativa/carbonilica. L’attività scientifica in questo ambito ha portato al deposito di 3 brevetti.

Orioli M, Vistoli G, Regazzoni L, Pedretti A, Lapolla A, Rossoni G, Canevotti R, Gamberoni L, Previtali M, Carini M, Aldini G. Design, synthesis, ADME properties, and pharmacological activities of β-alanyl-D-histidine (D-carnosine) prodrugs with improved bioavailability. ChemMedChem. 2011;6(7):1269-82.

4) Principi attivi naturali di interesse farmaceutico
In questa tematica sono raggruppate le ricerche volte all’isolamento, alla caratterizzazione, all’analisi quantitativa e alla valutazione dell’attività biologica in sistemi in vitro e in vivo di principi attivi naturali di interesse farmaceutico. In particolare, mediante tecniche estrattive e cromatografiche, spettroscopiche (UV-Visibile, NMR) e di spettrometria di massa, è stato possibile isolare da estratti di Aesculus hippocastanum L., Hedera helix L., Helichrysum italicum G. Don, Echinacea angustifolia, Krameria triandra, Ilex Paraguayensis, Rous Coriaria) e successivamente identificare i singoli componenti (o frazioni omogenee) ad attività antiedematosa, antijaluronidasica, antiossidante/radical scavenging, cardioprotettiva o vasorilassante. Gli studi attuali sono rivolti alla identificazione e caratterizzazione di molecole bioattive in diverse specie vegetali (Achillea millefolium, Sommacco) e in mieli di diversa origine botanica)

Aldini G, Regazzoni L, Pedretti A, Carini M, Cho SM, Park KM, Yeum KJ. An integrated high resolution mass spectrometric and informatics approach for the rapid identification of phenolics in plant extract. J Chromatogr A. 2011;1218(20):2856-64.

5) Radicali liberi, specie reattive all’ossigeno e sostanze ad attività antiossidante
In questa tematica di ricerca vengono sviluppate e applicate metodologie bioanalitiche per lo studio dei processi radicalici di tipo ossidativo e per la definizione del profilo antiossidante di sostanze di sintesi o isolate da matrici complesse di origine naturale di interesse farmaceutico, nutraceutico, erboristico e cosmetico. Tale attività viene studiata in modelli in vitro, ex-vivo e in vivo attraverso la determinazione, con metodologie sia convenzionali che innovative del potere antiossidante totale (ORAC, TRAP, TAP) di matrici complesse quali plasma e siero umano, alimenti, integratori nutrizionali, estratti vegetali, cosmetici.

Beretta G, Granata P, Ferrero, M, Orioli M, Maffei Facino R, Standardization of antioxidant properties of honey by a combination of spectrophotometric/fluorimetric assays and chemometrics. Anal Chim Acta. 2005; 533(2):185–191.

6) Studi ADMET
Un aspetto importante nel processo di drug discovery è la valutazione della stabilità metabolica, e l’identificazione strutturale precoce dei metaboliti di nuovi potenziali farmaci. Tali informazioni (identificazione delle sotto-strutture più labili) indicheranno le modificazioni strutturali da apportare per incrementare la stabilità metabolica, e al contempo, consentendo l’identificazione di eventuali prodotti di attivazione metabolica, costituiranno una valutazione precoce di sicurezza. La strategia generale di questa tematica, suddivisa in diverse attività complementari, consente di identificare potenziali criticità nel processo di sviluppo, ed avere l’opportunità di selezionare i candidati migliori. Dal momento che l’instabilità metabolica dei composti guida rappresenta uno dei principali fattori che limitano la progressione di nuove entità chimiche allo sviluppo clinico, la valutazione delle proprietà ADMET nelle fasi iniziali di drug discovery, consente di identificare e ottimizzare i composti guida sulla base dei parametri metabolici con conseguente ottimizzazione dell’intero processo di drug discovery in termini di costi e tempi.
In particolare il gruppo di ricerca si occupa di stabilità metabolica in diverse matrici di primati e roditori (frazioni epatiche, plasma, cute), stabilità in fluidi gastrici e intestinali ricostruiti, identificazione e caratterizzazione di metaboliti, tossicità cellulare, farmacocinetica nell’animale e nell’uomo, essendo state sviluppate le seguenti competenze:
a) Studio del metabolismo in vitro e in vivo di farmaci e loro interazione con i sistemi enzimatici detossificanti epatici
b) Studio dei processi di detossificazione epatica di xenobiotici in condizioni fisiologiche e patologiche
c) Sviluppo e applicazione di nuove metodologie in spettrometria di massa per la determinazione quali-quantitativa di farmaci e metaboliti in matrice complessa (cellule, tessuti, fluidi biologici)
d) Sviluppo e applicazione di metodi LC-MS/MS per gli studi ADMET in vivo.

Panusa A, Regazzoni L, Aldini G, Orioli M, Giombini A, Minghetti P, Tranquilli C, Carini M. Urinary profile of methylprednisolone acetate metabolites in patients following intra-articular and intramuscular administration. Anal Bioanal Chem. 2011;400(1):255-67.

Collaborazioni Nazionali ed Internazionali
Dipartimento di Bioscienze (Università degli Studi di Milano).
Dipartimento di Scienze del Farmaco (Università degli Studi di Pavia)
Dipartimento di Scienze del Farmaco (Università degli Studi del Piemonte Orientale)
Dipartimento di Scienza e Tecnologia del Farmaco (Università degli Studi di Torino)
Dipartimento di Farmacologia Preclinica e Clinica (Università degli Studi di Firenze)
Dipartimento di Medicina Molecolare e Clinica (Università La Sapienza di Roma)
Dipartimento di Scienze Farmaceutiche (Università degli Studi di Catania)
Oncology Business Unit (Nerviano Medical Sciences, Nerviano)
Coni (Comitato Olimpico Nazionale Italiano)
Ministero della Salute
Dipartimento del Farmaco (Istituto Superiore di Sanita’, Roma)
Dipartimento di Nefrologia e Dialisi (Ospedale A. Manzoni, Lecco)
Graduate School of Bioagricultural Sciences, Nagoya University (Japan)
Jean Mayer USDA Human Nutrition Research Center on Aging, Tuft’s University (Boston , USA)
Division of Human Nutrition, Department of International Health, Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health (Baltimora, USA)
Department of Movement and Sport Sciences, Ghent University (Belgium)
Department of Chemical and Physical Biology, Centro de Investigaciones Biológicas (Madrid, Spain)
Institute for Drug Research - Department of Pharmacology  (The Hebrew University Faculty of Medicine, Jerusalem, Israel)
Abteilung Neuropathologie Neurozentrum Universitätsklinikum Freiburg (Germany)

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